ПЦР анализ — что это за анализ

Как подготовиться к ПЦР-диагностике?

Правила довольно просты:

• Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища (спринцевания, свечи). Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию (если таковая проводилась) не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа;
• Кровь сдается из вены утром натощак;
• Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов – максимум 2 часа;
• Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой. Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз.
• Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки.

Мнение врача:

ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) – это высокоточный метод исследования, который позволяет выявить наличие или отсутствие определенной последовательности ДНК или РНК в образце. Врачи отмечают, что ПЦР-анализ широко используется в медицине для диагностики инфекционных заболеваний, определения генетических отклонений, а также в судебной медицине и научных исследованиях. Благодаря своей высокой чувствительности и специфичности, этот анализ является важным инструментом для точной диагностики и мониторинга различных заболеваний.

ПЦР анализ – что это такое

Суть метода полимеразной реакции

У каждого живого организма имеется свой уникальный набор хромосом. Ни у одного существа он не повторяется, но все хромосомы образованы ДНК — дезоксирибонуклеиновой кислотой. ДНК состоит из множества мельчайших молекул, называемых нуклеотидами.

Последовательности цепочек этих молекул образуют гены. Гены же отвечают за кодировку синтеза огромного количества белков, таких, как глобулин, коллаген и т. д.

Последовательность нуклеотидов у каждого организма уникальна, за исключением схожих участков ДНК, отвечающих за относительное однообразие в пределах вида организма. Методом ПЦР находят фрагменты нуклеиновой кислоты и определяют, какому виду микроорганизма они принадлежат.

Но анализ ДНК небольшого количества микробов будет малоинформативен. Чтобы иметь возможность выявить и исследовать определенные видовые закономерности, необходимо увеличить количество нуклеотидов во много сотен раз. Для этого также используют методику ПЦР.

Чтобы получить достаточное количество материала для проведения исследования, к ДНК микроорганизма добавляют определенные нуклеотиды, а также ДНК-полимеразу. Этот фермент обеспечивает многократное копирование интересующего исследователей участка.

Катализатором (веществом, запускающим реакцию) процесса служат нити РНК, крепящиеся к гену, который и необходимо изучить. За несколько часов анализа всего из одного нуклеотида можно получить достаточное количество материала для исследований.

Интересные факты

1. ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) был изобретен в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. За это открытие он получил Нобелевскую премию по химии в 1993 году.

2. ПЦР-анализ используется для обнаружения и амплификации (увеличения количества) определенных фрагментов ДНК. Это позволяет диагностировать различные заболевания, такие как инфекции, генетические нарушения и онкологические заболевания.

3. ПЦР-анализ стал незаменимым инструментом в молекулярной биологии и медицине. Он используется для различных целей, включая диагностику заболеваний, идентификацию микроорганизмов, исследование генетических мутаций и клонирование генов.

Что такое ПЦР?

Особенности теста ПЦР на новый коронавирус

Вирус SARS-CoV-2, как все респираторные агенты, проникает внутрь через слизистые оболочки носа, глаз или рта. В клетках он закрепляется, цепляясь специфическими шипами к рецепторам на их мембранах. Наиболее уязвимы для поражения ткани системы дыхания, мочевыделения, пищеварения, ЦНС, сердца. Их поверхность содержит рецепторы АПФ2 и ACE2, к которым тропны белки коронавируса.

В первые дни после заражения SARS-CoV-2 активно размножается в эпителии носоглотки. Инфекция содержится в отделяемом слизистом секрете и слюне. Носители, не подозревая об этом, распространяют ее при чихании, кашле, глубоком дыхании. Даже не имея симптомов такие люди опасны для окружающих. Выраженный COVID в большинстве случаев не отличается от обычных ОРВИ, специфических проявлений у него нет. Определить, заражен ли человек новым патогеном, способна только ПЦР.

В крови и лимфе коронавирусы не циркулируют. Пробы на анализ берут со слизистых оболочек носоглотки. Опыт медиков показал, что у людей с бессимптомным и манифестным течением болезни точностью исследования — около 80%, довольно велика вероятность ложноотрицательных результатов. На эпителии возбудитель долго не задерживается, подвергаясь иммунным атакам. По этой причине рационально повторять обследование несколько раз. А при длительном невыявлении вируса у людей с подозрением на COVID следует сдавать кровь на антитела к инфекции методом ИФА.

Опыт других людей

ПЦР-анализ – это высокоточный метод определения наличия или отсутствия определенной ДНК или РНК в образце. Люди отмечают, что данный анализ является надежным и широко используется в медицине для выявления инфекционных заболеваний, генетических отклонений и определения родственных связей. Он также активно применяется в судебной медицине и научных исследованиях. Благодаря своей точности и чувствительности, ПЦР-анализ получил признание как врачей, так и пациентов.

ПЦР анализ — что это за анализ

Плюсы и минусы ПЦР

К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты:

• Точность. Диагностические приёмы, на которые опиралась медицина до начала эпохи ПЦР, зачастую основывались на косвенном определении возбудителей болезни: в ходе анализа искались антитела к ним, признаки их присутствия, продукты их жизнедеятельности. ПЦР же узнает конкретный микроорганизм «в лицо», обнаруживает его ДНК или РНК, следовательно, появляется возможность выбрать максимально эффективную тактику лечения;
• Надежность. По этому параметру ПЦР-диагностика далеко опережает конкурентов и приближается к 100%. Правильнее будет сказать так: если условия подготовки, забора, транспортировки, проведения анализа и оценки итогов были соблюдены неукоснительно, никакой ошибки быть не может. Ложноотрицательный результат возможен только в случае некорректно взятого материала, а ложноположительный – в случае попадания посторонних примесей в образец на любом из этапов исследования;
• Чувствительность. Методика ПЦР уникальна ещё и тем, что позволяет обнаружить инфекционного агента в пробе, даже если там содержится всего одна молекула его ДНК. Это открывает широкие возможности по своевременной диагностике заболеваний или даже предотвращению их развития, если возбудитель ещё не размножился и не активизировался в организме человека. Кроме того, ПЦР-анализ может определить так называемую вирусную нагрузку – вычислить примерное количество копий вируса в крови и дать ответ, насколько тяжело течение болезни, вероятен ли её рецидив в случае ремиссии, существует ли риск её передачи другим людям;
• Универсальность. Можно сдать ПЦР-анализ всего один раз и получить ответ, имеются ли у вас какие-либо инфекции из целого списка вероятных диагнозов. Особенно это актуально в случае с заболеваниями, передающимися половым путём – они нередко соседствуют друг с другом. Загрузив образец биоматериала пациента в амплификатор и добавив в пробирку праймеры сразу нескольких возбудителей, специалист сможет обнаружить присутствие каждого из них;
• Скорость. Как мы уже рассказали выше, весь цикл ПЦР-диагностики занимает по времени не более 2-3 часов. Разумеется, нужно сделать поправку на загруженность лаборатории и процесс сбора биоматериала, но большинство современных диагностических центров предоставляют своим пациентам готовые результаты анализа ПЦР в день обращения или на следующие сутки.

Как ни странно, недостатки у полимеразной цепной реакции тоже есть:

• Очень высокие требования к чистоте образца. Попадание в пробу посторонних примесей на любом из этапов диагностики грозит получением ложноположительного результата. А микробов вокруг человека миллионы, они содержатся практически везде;
• Вероятность амплификации ДНК мертвых микроорганизмов. Бывает так, что человек уже переболел, а молекулы погибшего возбудителя всё ещё присутствуют в его организме, прибор определяет их и также даёт ложноположительный ответ;
• Проблема неопознанных инфекций и мутаций. Теоретически может быть так, что в образце будут присутствовать такие микробы, для которых вообще ещё не разработаны праймеры, или они существуют, но по какой-то причине не были включены в реакцию. Кроме того, возбудители инфекций постоянно мутируют, приспосабливаясь к меняющимся условиям и новым лекарствам. Соответственно, уже имеющиеся праймеры теряют актуальность, потому что перестают соответствовать своему прототипу.

Материал для анализа

ПЦР-диагностика находит своё применение при выявлении заболеваний разных профилей. В зависимости от симптоматики, осмотра и предварительного обследования материалом могут быть:

• моча;
• кровь;
• выделения из половых органов;
• мазок из влагалища, уретры;
• мазок из зева;
• желудочный сок.

Особой подготовки требует только забор материала из женских половых органов. Следует воздержаться от половых контактов в течение трёх суток перед сдачей анализа, по возможности, не мочиться перед посещением гинеколога, поскольку моча может смыть патогенную флору. Наиболее благоприятное время для проведения исследования 3-5 дней после окончания менструации.

Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?

Вот лишь неполный список тех вредоносных микроорганизмов, которые можно обнаружить с помощью ПЦР-анализа:

• Обширное семейство герпес-вирусов, в том числе цитомегаловирус, варицелла-зостер, вирус Эпштейна-Барра и другие;
• ВИЧ;
• Гепатиты;
• Папилломовирусы;
• Цитомегаловирус;
• Парвовирусы;
• Аденовирусы;
• Риновирусы;
• Пикорнавирусы;
• Рубивирусы;
• Микобактерии туберкулёза;
• Гемофильная палочка;
• Холерный вибрион;
• Бледная трепонема;
• Стафилококки;
• Менингококки;
• Стрептококки;
• Гонококки;
• Легионеллы;
• Шигеллы;
• Сальмонеллы;
• Бруцеллы;
• Клостридии;
• Листерии;
• Боррелии;
• Хеликобактерии;
• Токсоплазмы;
• Микоплазмы;
• Уреаплазмы;
• Хламидии;
• Трихомонады;
• Гарднереллы;
• Кандиды.

Методика ПЦР нашла своё применение не только в клинической медицине, но и в криминалистике, археологии, экологии, ветеринарии, фармакологии, генной инженерии и производстве продуктов питания – везде, где может оказаться полезным анализ ДНК.

[Видео] Полимеразная цепная реакция:

Принцип работы

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

Схема трех стадий полимеразной цепной реакции

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причём для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

Расшифровка результатов

Интерпретацией итогов занимаются врачи. Самостоятельно можно сделать выводы только о характере находки. Но этого недостаточно.

При кажущейся простоте, есть вероятность что-то упустить. Итоги нужно оценивать в системе с находками прочих диагностических мероприятий.

Анализ методом ПЦР дает два возможных результата:

• Положительный. Если следы генетической аномалии или чужеродности в биоматериале присутствуют. Что прямо указывает на развитие и существование патологического процесса.
• Отрицательный. Если в искомом образце измененная ДНК или иные находки отсутствуют.

Отсутствие следов еще не говорит, что расстройства нет. Потому интерпретацию стоит доверить лечащему специалисту.

Мазок на ПЦР дает и другие возможные результаты, например, если исследовалась степень родства, тогда также вероятен положительный или отрицательный итог. Первое означает, что генетическая идентичность действительно присутствует. И наоборот.

Расшифровка результатов ПЦР требует учета данных прочих исследований, хотя формально находки, полученные в процессе полимеразной цепной реакции исчерпывающе и однозначно описаны в бланке исследования, клиническом заключении лаборантов.

Вопрос в любом случае стоит оставить на усмотрение врача.

Результаты исследования

Результаты ПЦР обычно готовы уже через сутки после сдачи анализов. Качественный анализ выглядит просто. ПЦР расшифровка не требуется, так как обычно в первой графе указывается возбудитель, во второй — результат. Например, так:

В скобках указывается метод — ПЦР. Сделать интерпретацию не сложно. У пациента из примера обнаружен качественным методом ПЦР цитомегаловирус (ЦМВ) и герпес. Уреаплазма и хламидия: возбудители инфекции не обнаружены.

Количественный анализ даёт числовой результат, обычно в МЕ/мл. Это означает что в 1 мл исследуемого образца обнаружено определённое количество копий ДНК или РНК возбудителя, в международных единицах. В зависимости от величины определяется тяжесть инфекции. Обычно для определения вирусной нагрузки исследуют кровь, так как при заболевании вирусы свободно циркулируют в крови.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.

Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.

Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Показания для назначения исследования ПЦР

Назначение ПЦР-диагностики оправдано в случае инфекционных заболеваний и необходимости определить природу возбудителя.

Также метод ПЦР применяется при:

• необходимости точной идентификации возбудителя;
• диагностике некоторых генетических заболеваний;
• анализе образцов биопсии, исследование которых стандартными методами невозможно;
• необходимости идентификации личности путем сравнения части ДНК человека с биоматериалом заведомо известного происхождения;
• диагностике злокачественных новообразований и лейкоза;
• проведении генетических экспериментов с животными с заложенными еще до их рождения генетическими заболеваниями.

Также есть много возможных способов применения анализа ПЦР при проведении исследований в области медицины и биологии, от испытания степени эффективности лекарств уже на молекулярном уровне и до создания полностью автономных живых организмов с определенными свойствами.

На данный момент ПЦР-анализ применяется для диагностики достаточно обширного круга заболеваний, например:

• Самых страшных заболеваний — ВИЧ-инфекции и гепатитов А, В, С, Е;
• заболеваний, передающихся половым путем (ИППП);
• туберкулеза;
• внутриклеточных инфекций (вирусы, бактерии) и многих других болезней.

При подозрении на наличие ЗППП направление выдает гинеколог, уролог или андролог. При туберкулезе исследование назначает фтизиатр, а при подозрении на ВИЧ или вирусные гепатиты — инфекционист. Также для более точной постановки диагноза ПЦР используют онкологи, онкогематологи, генетики.

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Что можно обнаружить методом ПЦР

По результатам обследования есть возможность выявить группу патологических процессов.

Папилломатоз

Провоцируется особым одноименным вирусом. Вызывает образование на коже и внутренних органах хорошо знакомых многим наростов. В самом простом случае, речь идет о бородавках.

Но существуют и другие аномальные структуры. Например, невус (родинка), остроконечная кондилома. Последние образуются на репродуктивных органах и в области заднего прохода, передаются половым путем.

Многие штаммы вируса папилломы человека (а известно их более 150) потенциально онкогенны. Способны спровоцировать рак. Потому ПЦР незаменима при ранней диагностике и разработке индивидуальных мер профилактики, лечения.

Герпес

Любого типа. Известно более 6-и штаммов этого вируса.

• Первый провоцирует образование папул в полости рта и на губах.
• Второй — транспортируется половым путем и плохо поддается коррекции.
• Третий — это вирус Варицелла-Зостер, которые вызывает ветряную оспу.
• Четвертый становится виновником мононуклеоза.
• Пятый — цитомегалии.
• Шестой влияет на работу головного мозга.

Так можно продолжать и далее. Суть в том, что с помощью ПЦР удается выявить сам герпес и его штамм, определить характер и давность поражения, патологического процесса. В этом суть диагностики.

Гепатит

Воспаление печени. Полимеразная цепная реакция назначается не только для определения самого факта расстройства. Суть в другом.

ПЦР диагностика инфекций дает возможность дифференцировать септические и токсические, прочие формы гепатита, определить конкретный штамм вируса, который спровоцировал патологический процесс.

Кандидоз

Молочница. Вызывается грибком с идентичным названием. Поражает слизистые оболочки. В том числе полость рта, половые органы женщины (реже — мужчины).

Вызывает массу осложнений и дискомфортных ощущений. ПЦР тест назначается в качестве верифицируемого, подтверждающего догадки метода, исследуется параллельно с данными анамнеза, визуальной оценки, симптоматики.

Хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз и прочие венерические инфекции.

СПИД

Вирус ВИЧ вызывает нарушения работы иммунитета. На ранних стадиях патологического процесса есть риск не заметить симптомы. Но именно этот момент — лучший для терапии. Поскольку дальше начинаются необратимые изменения в органах и системах.

Болезнь не удается взять под контроль, обеспечить продолжительную жизнь пациенту также невозможно. ПЦР назначается для раннего выявления патологического процесса.

Генетические аномалии

Любого типа. Потому методика представляет такую ценность для диагностики наследственных аномалий. Способ не до конца освоен, потому считается перспективным.

Как уже было сказано, с помощью методики можно установить отцовство. Используется отдельная модификация анализа.

Частые вопросы

Как берут ПЦР?

Для исследования мазок берут с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. При взятии мазка из носоглотки зонд вводят по наружной стенке носового хода на достаточную глубину. Мазок, взятый со слизистой преддверия носа, может не выявить РНК коронавируса SARS-CoV-2.

Для чего используется ПЦР?

КриминалистикаУстановление отцовстваМедицинская диагностика (ПЦР-тест)Персонализированная медицинаКлонирование геновСеквенирование ДНКМутагенезМолекулярное сексирование

Как берут анализ ПЦР у женщин?

Как правильно сдать ПЦР? Для выявления инфекций половых органов у мужчин и женщин, для анализа берутся выделения из половых органов, мазок из мочеиспускательного канала, мазок из шейки матки, а также моча. Для диагностики вирусного гепатита на анализ берут кровь.

Как сдавать анализ ПЦР на инфекции?

приходите на обследование в период обострения инфекции,после незащищённого (сомнительного) полового контакта должно пройти не менее трех недель,закончите прием антибиотиков за 3 недели до анализа ЗППП,воздержитесь от половых отношений в течение 36 часов,во время менструации исследование не проводится.

Полезные советы

СОВЕТ №1

Познакомьтесь с основными принципами ПЦР анализа, чтобы понимать, как он работает и для чего используется. Это поможет вам лучше понимать информацию, которую вы получите из результатов анализа.

СОВЕТ №2

Обратитесь к специалистам, если у вас возникли вопросы или сомнения относительно ПЦР анализа. Медицинские работники смогут предоставить вам дополнительную информацию и объяснить все аспекты анализа.